Окраска по паппенгейму цитологических мазков

7.Приготовление цитологического мазка, правила фиксации и окраски. Теория цитологических окрасок

Окраска по паппенгейму цитологических мазков

Техникаприготовления мазковПолученноеколичество материала не всегда определяетвозможности диагностики, иногда оченьмалое количество материала являетсядостаточным для постановки диагноза.

Наличие большого количества крови частоявляется помехой.

При её наличии мазкинеобходимо делать как можно скорее,иначе наступает свертывание и изсвернувшегося сгустка очень трудносделать мазки и провести исследование.

Материал наносятна стекло и очень аккуратно делаютмазки, т. к. клетки очень ранимы, а наличиебольшого количества разрушенных клетокмешает правильной диагностике.

Правильноприготовленный мазок из нормальной илипатологической измененной ткани долженотвечать следующим условиям:

  • Мазок должен начинаться на 1 см от узкого края предметного стекла и заканчиваться примерно в 1,5 см от другого края предметного стекла; мазок не должен достигать длинного края стекла, между мазком и краем предметного стекла должно оставаться расстояние примерно 0,3 см.
  • Хороший мазок должен быть максимально тонким (максимально приближающимся к однослойному), равномерной толщины (не волнообразным) на всём протяжении.
  • Мазок из осадка жидкого материала (жидкость из серозной полости, смыв из различных органов, содержимое кистозной полости и т.п.) должен заканчиваться у одного из узких краёв предметного стекла в виде следа, оставленного как бы тонкой щёткой.
  • Клетки в мазке должны быть равномерно распределены, все участки мазка должны хорошо просматриваться и не содержать «толстые участки», содержащие непросматриваемые (плохо просматриваемые) скопления или комплексы клеток.

Изжидких пунктатов мазкиготовят подобно мазкам крови, еслиполученная масса плотная или комковатая,то помимо мазков можно приготовить иотпечатки на стекле.

Метод отпечатковимеет определенные преимущества.

  • Во-первых, клетки подвергаются гораздо меньшему травматизму.
  • Во-вторых, есть возможность расположения клеток пластами, что помогает при описании цитологического препарата характеризовать и соотношение клеток между собой.
  • В-третьих, если материал богат кровью, его необходимо нанести на стекло и тогда выбирать оттуда “беленькие крупинки” и ими делать мазки.

Метод отпечатковприменим при использовании цитологическогометода во время операционноговмешательства, а так же получениибиопсии. Этот метод может быть использован,как самостоятельно, так и параллельнос гистологическим анализом.

В этихслучаях помимо пункций проводят получениеотпечатков с удаленных или обнаженныхорганов, с помощью прикосновения стеклапредметного к исследуемой ткани.

Также можно готовить препараты при полученииматериала методом соскоба

Жидкости,полученные при пункции,тут же центрифугируют, далее сливаютверхний слой из центрифуги, а из осадкаделают  мазки, которые и подвергаютцитологическому исследованию. В некоторыхслучаях приготовленные препараты можнопросмотреть под микроскопом, однакодиагностику патологии необходимопроводить только по окрашенномупрепарату.

Длядифференциальной диагностики используютцитохимические методики. Чтобы установитьхарактер секреции и межуточного вещества,используют окраски, применяемые вгистологии (мукармин для выявленияслизи, окраска пикрофуксином длявыявления коллагена, остеоида).

Если материаладостаточно, клетки сохраненные, хорошоприготовлен и окрашен препарат, даетсязаключение о гистологической форме суказанием степени дифференцировки(низкодифференцированная аденокарцинома,плоскоклеточный ороговевающий рак). Втех случаях, когда материал и цитологическаякартина недостаточно убедительна дляустановления конкретного диагноза,дается описание препарата, отдельныхклеточных элементов и, при возможности,их оценка.

Необходимойпредпосылкой для точной оценкиморфологических особенностей клетокв мазке  является правильносделанный, качественно фиксированный,хорошо окрашенный и методологическикорректно изученный мазок, поступающийв лабораторию в сопровождении необходимыхклинико-инструментальных и анамнестическихданных. Невыполнение этих условий ведетк неправильному распределению клетокткани, неполному выявлению ихморфологических особенностей, «пропуску»важной диагностической информации напредметном стекле или отсутствиюкорригирующей клинической информациии, тем самым, к ошибочной оценкецитологической картины, а значит кнеполноценному или ошибочного диагнозу.Если мазки были приготовлены внелаборатории, то в соответствии с темиже требованиями оценивается ихмакроскопический вид. Сотрудникилаборатории должны постоянно обучатьпредставителей клинических отделений,участвующих в приготовлении мазков.

Приготовлениестекол

Стекла дляприготовления цитологических препаратовдолжны быть чистые, обезжиренные исухие.

1. Стекла тщательнопромывают щеткой в теплой мыльной (илис моющим средством) воде.

2. Основательнопромывают в проточной теплой воде.

3. Затем кипятят1—2 часа в воде с добавлением соды (2—3%)или моющего средства.

4. После хорошоополаскивают в чистой горячей воде ипромывают в проточной (1—2 часа).

Обработанные ипромытые в воде стекла протирают мягкойтряпкой, держа стекла за края, и хранятв смеси Никифорова (равные части 96°спирта и эфира). По мере надобностипинцетом извлекают стекла из смесиНикифорова и протирают сухой тряпкой.Обработанные таким образом стекла могутбыть использованы для приготовленияцитологических препаратов.

Дляпроведения цитохимических исследований оченьхорошие результаты дает обработкапредметных стекол и других стеклянныхпредметов в хромовойсмеси следующегосостава:

Двухромовокислыйкалий (бихромат калия) — 100 г; вода горячая— 1000 мл; неочищенная серная кислота —100 мл.

Дляприготовления хромовой смеси растворяютв горячей воде двухромовокислый калий,затем охлаждают раствор и после этогодобавляют серную кислоту.

Кислоту льютосторожно (обязательно в вытяжномшкафу), при этом смесь весьма сильнонагревается и приобретает темно-коричневыйцвет.

В этом составе предметные стеклаи другую стеклянную посуду выдерживают2—3 дня, а после промывают в проточнойводе в течение 1—2 часов.

На хорошо обезжиренномпредметном стекле вода должна растекатьсятонким слоем, а не собираться в капли.

Фиксация

Фиксация мазкапроводится в соответствии с методикой,обусловленной биологическимматериалом, взятием  дляцитологического исследования  (влажная фиксация биологическогоматериала  или  подсушиваниеего на воздухе). При влажной фиксацииприготовленный мазок помещается вфиксирующую жидкость, затем подсушиваемна воздухе. Недостаточная фиксациямазка ведет к некачественному окрашиваниюклеток.

  1. Правильная фиксация мазка  обусловливает стойкость клеток по отношению к содержащейся  в красках  воде, которая  в нефиксированном мазке изменяет строение клеточных элементов. При фиксации мазка происходит коагуляция белка, в результате чего клетки прикрепляются к предметному  стеклу;

  2. При фиксации цитологических препаратов должны использоваться фиксаторы: метиловый спирт, этиловый спирт, смесь Никифорова, фиксатор Май- Грюнвальда, фиксатор Лейшмана, ацетон (для иммунноцитохимии).

Еслиэто специально не оговорено методикой,то, как правило, фиксируют высушенныемазки. Лучшим фиксатором для цитологическихпрепаратов является метанол.В метаноле фиксацию проводят от трехдо десяти минут.

Крометого, для фиксации может бытьиспользован этиловыйспирт 100°.Время фиксации составляет 10—30 минут.

Вкачестве фиксатора может использоваться смесьНикифорова (времяфиксации минимум 15 минут, максимум 1—2часа). Некоторые красители (Лейшман,Май-Грюнвальд) являются одновременнофиксаторами.

Окраскацитологических препаратов

Качественноеокрашивание позволяет правильноидентифицировать клеточные элементымазка и оценить их особенности примикроскопии. В адекватно окрашенноммазке структуры цитоплазмы,  ядра,ядерного хроматина, ядрышек окрашеныэлективно.

  1. При применении любой методики окрашивание мазка важно точно соблюдать последовательность процедур приготовления растворов и временные промежутки времени в течение процесса окрашивания.

  2. Существующие в продаже партии красителя имеют различную интенсивность окраски.

    Это обязывает опытным путём установить оптимальные концентрации (разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, который устанавливает при окрашивании серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя, меняя длительность его воздействия. При приготовлении растворов необходимо учитывать рН воды: она должна быть нейтральной (рН 6,8 – 7, 2) что обеспечивается использованием буферных растворов.

  3. Рекомендуемые методы окрашивания цитологических мазков: азур – эозиновый, по Романовскому – Гимзе, Лейшману, Маю – Грюнвальду, Паппенгейму; гематоксилин – эозиновый, метод Папаниколау.

  4. Для уточнения диагноза рекомендуется использование цитохимических и иммуноцитохимических методов анализа в соответствии с принятыми методиками.

8.Современныепредставления о гемопоэзе. Доказательтствасуществования родоначальной гемопоэтическойклетки (эксперименты J.TillMcCullach).1907-1909гг. – унитарная (монистическая) теориякроветворения предложена русскимгистологом-цитологом Максимовым.

Онадо сих пор является ведущей теорией,говорит о том, что в основе гемопоэзалежит одна- единственная клетка, дающаяначало всем росткам кроветворной ткани(свойство полипотентности). ПосколькуМаксимов был гистологом, он естественнопытался найти морфологические признакиПСКК.

Максимов считал, что оналимфоцитоподобная, мезенхимная посвоему происхождению.

1961 г.

– Till, McCulloch(Австралия) вводили взвесь костногомозга внутривенно смертельно облученныммышам, у которых в селезенке на 7-14 суткиформировались макроколонии, состоящиеиз разного типа миелоидных элементов(гранулоциты, эритроциты, мегакариоциты,смешанные колонии), впоследствииобнаружены лимфоидные клетки. •Ретрансплантация отдельных колонийтакже приводит к расщеплению и образованиюразных типов колоний – полипотентностьи способность к самоподдержанию КОЕс8-12.

Источник: //studfile.net/preview/6831671/page:3/

Окраска мазков

Окраска по паппенгейму цитологических мазков

Окрашивание мазков крови требует внимания и известного опыта со стороны исследователя. Прекрасно приготовленный и хорошо зафиксированный мазок может быть испорчен плохим окрашиванием. Причинами неудачного окрашивания может быть плохое качество краски или же несоблюдение правил окрашивания.

Окрашивание мазков крови должно быть прогрессивным и паноптическим. под прогрессивным окрашиванием понимают продолжительное окрашивание слабыми растворами краски. Окраска зависит от прямого сродства элементов крови к краске.

Паноптическим окрашиванием выявляется возможно большее число элементов крови с мельчайшими нюансами тонов окраски. В отличие от комбинированного метода, паноптический требует применения нейтральных красок, а не смеси основных и кислых красок.

Рис. Приспособление для окрашивания мазков.

Среди нейтральных, паноптических красок наиболее важное место занимают азур-эозиновые смеси, изготовляемые по принципу Романовского (1891 г.).

В СССР в настоящее время выпускается готовый раствор азур-эозина (по Романовскому), в Германии широкое распространение нашла краска Гимза, выпускаемая в продажу под названием «Giemsa's Losung fur Romanowsky farbung», состоящая из: азур 2-эозина—3,0, Азур 2—0,8, глицерина химически чистого 125 мл, метилового алкоголя химически чистого 375 мл.

Окраска по Романовскому— Гимза. Для окрашивания используется готовый раствор краски.

Перед употреблением краска разводится из расчета 1—2 капли на 1 мл дистиллированной Зафиксированный препарат помещают мазком вверх на стеклянные палочки над чашкой ипокрывают поверхность мазка высоким слоем разведенной краски. Окрашивание можно производить также в кюветах, наполненных раствором краски.

Окрашивание продолжается 15—30 минут; для свежих мазков и в сухую жаркую погоду времени требуется меньше, чем при окраске старых мазков или при окраске в сырую и холодную погоду. По истечении определенного времени краску смывают, лучше дистиллированной водой, мазок для высушивания ставят вертикально на пропускную бумагу.

Высушивание мазка можно производить подогреванием на руке.

При окрашивании по методу Романовского—Гимза необходимо соблюдать ряд предосторожностей, чтобы получить правильную окраску:

1) вода должна иметь рН=6,6—6,8;

2) посуда, в которой разводится краска, должна быть чистой;

3) раствор краски готовится ex tempore, перед окраской, а не заранее,

Так как наилучшее окрашивание получается в момент разбавления алкогольного раствора водой;

4) краску следует добавлять в воду по каплям, а не наливать сразу;

5) концентрация раствора не должна превышать три капли на 1 мл;

6) для получения красивой дифференциальной окраски рекомендуется
оставлять дистиллированную воду на мазке после промывки в течение 1 минуты.

Правильная окраска узнается по внешнему виду. Макроскопически мазок должен быть окрашен в розоватый цвете незначительным фиолетовым оттенком. Серые или серо-голубые мазки указывают на избыток щелочи, яркокрасные— на избыток кислоты или слишком кратковременное окрашивание.

Метод Романовского—Гимза особенно хорош при окрашивании мазков на кровепаразитов, а также при окрашивании одновременно нескольких мазков.

Модификация окраски мазков крови краской Романовского — Г имза по Филипсону. Для окрашивания по этому методу требуется особое приготовление краски, которое можно производить заранее, но можно и в момент окрашивания. Берется одна часть жидкой краски Романовского и три части этилового спирта (ректификата). После смешивания со спиртом краска сразу же пригодна для употребления.

На нефиксированный мазок крови наносится 10—15 капель приготовленной вышеуказанным способом краски. Через 10—15 минут, необходимых для фиксации мазка, наливается примерно 0,5—1 мл дистиллированной воды, которая тщательно смешивается с краской.

Окрашивание мазка продолжается в течение 20—30 минут (длительность периода окрашивания изменяется в зависимости от температуры воздуха, качества краски и некоторых других причин и может быть установлена в каждой лаборатории самостоятельно).

Затем краска смывается дистиллированной водой и мазок высушивается. Высохший мазок годен для исследования.

Окраска по Лейшману. Окраска производится готовым раствором краски Лейшмана. Метод не требует предварительной фиксации, а потому считается быстрым и сравнительно удобным.

На нефиксированный мазок крови наслаивают 15—20 капель краски Лейшмана и оставляют на 3 минуты. Краска, содержащая метиловый алкоголь, фиксирует мазок и одновременно окрашивает клетки крови.

По истечении определенного времени в краску добавляется такое же количество дистиллированной воды (15—20 капель) и при помощи стеклянной палочки или пипетки осторожно перемешивают краску с водой. Через 7—15 минут разведенную краску смывают дистиллированной водой.

Так же, как и при окрашивании по Романовскому—Гимза, дистиллированную воду лучше в течение 1 минуты оставить на мазке. Затем мазок ставится в вертикальное положение или же высушивается на руке. Краска Лейшмана дает очень хорошие результаты при окрашивании мазков из костного мозга.

Окраска по Ма й-Г рюнвальд. Окрашивание производится готовым раствором краски Май-Грюнвальд. На нефиксированный мазок: крови наносится 15—20 капель краски и оставляют на нем 3 минуты.

По истечении указанного времени на мазок наслаивают такое же количество капель дистиллированной воды (15—20 капель). Краска хорошо перемешивается с водой при помощи стеклянной палочки и докрашивается еще 10—15 минут.

Дальше препарат промывается дистиллированной водой и высушивается.

Окраска по Паппенгейму. Этот метод соединяет преимущества окраски по Май-Грюнвальду и Романовскому—Гимза. Окраска является комбинированной и заключается в том, что мазок вначале окрашивается по методу Май-Грюнвальда, а затем докрашивается по методу Романовского— Гимза.

На нефиксированный мазок крови наносится 15—20 капель краски Май-Грюнвальда и выдерживается в течение 3 минут. После этого к краске добавляется такое же количество дистиллированной воды и после перемешивания оставляют еще на 3 минуты. Затем краска сливается, стекло ставится краем на пропускную бумагу, чтобы стекла вода.

После этого на невысохший еще мазок наслаивается свежеприготовленная краска Романовского—Гимза (15— 20 капель краски на 10 мл воды) и мазок докрашивается дополнительно 15— 30 минут, смотря по давности мазка. По истечении указанного времени краска смывается и мазок высушивается.

Если мазки окрашиваются интенсивно, их можно раскрасить дистиллированной водой в течение 1 минуты, а затем высушить.

Витальная окраска мазков крови для выявления гра-нулофиламентозной субстанции в эритроцитах. Для витального окрашивания используются бриллианткрезилбляу, толлуидинбляу, нейтральрот, азур и некоторые другие краски.

Самой употребительной является бриллианткрезилбляу, которая окрашивает быстрее других красок и вместе с тем дает более четкий рисунок субстанции. Для окрашивания применяется спиртовой раствор краски в разведении 1 :80.

Используется для этой цели абсолютный алкоголь.

На слегка подогретое предметное стекло стеклянной палочкой наносится капля краски и быстро размазывается наподобие мазка крови. На стекле образуется едва заметный серовато-фиолетовый налет краски. Окрашенные таким образом стекла могут храниться продолжительное время в сухом месте.

На окрашенной поверхности стекла делают в дальнейшем мазки крови, которые тотчас же вносятся во влажную камеру на 3—5 минут. Влажную камеру можно приготовить из бактериологических чашек.

В нижнюю чашку по окружности кладется фильтровальная бумага, смоченная в воде; в центр чашки можно положить две спички, на которые и помещается предметное стекло мазком вверх, после чего чашка закрывается другой чашкой. По истечении определенного времени мазок вынимают из влажной камеры и высушивают.

Витально окрашенные мазки можно дополнительно окрасить краской Романовского—Гимза или Лейшмана. Дополнительное окрашивание дает очень красивые мазки, но часть субстанции при этом исчезает.

Для устранения этого недостатка витально окрашенный мазок мы докрашиваем предварительно 1%-ным спиртовым раствором метиленовой синьки в течение 1—2 минут с последующей докраской по Лейшману.

Субстанция при таком окрашивании количественно не уменьшается и становится рельефнее.

Источник: //veterinarua.ru/...zhivotnykh-vasilev-a-v-1956/1894-okraska-mazkov.html

Оценка качества окрашенного цитологического препарата

Окраска по паппенгейму цитологических мазков

Световая микроскопия

Микроскопирование — основной метод изучения клеток. Современные микроскопы представляют собой разнообразные сложные оптические системы, обладающие высокой разрешающей способностью и позволяющие изучать очень тонкие детали строения клеток.

Размер самой маленькой структуры, которую можно видеть в микроскопе, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d0). В основном оно зависит от длины световой волны λ, и эта зависимость приближенно выражается формулой d0 = λ / 2.

Таким образом, чем меньше длина световой волны, тем меньше разрешаемое расстояние и тем меньшие по размерам структуры можно видеть в препарате (т.е. выше «разрешение» микроскопа).

Понятие «увеличение микроскопа» относится к его оптической системе и выражается в произведении увеличений объектива и окуляра. Однако «разрешение» микроскопа зависит от характеристик объектива и не зависит от окуляра.

Для изучения цитологических препаратов чаще применяют обычные световые микроскопы различных марок, когда в качестве источника освещения используют естественный или искусственный свет.

Минимальная длина волны видимой части спектра света соответствует примерно 0,4 мкм (фиолетовый спектр).

Следовательно, для обычного светового микроскопа разрешаемое расстояние равно приблизительно 0,2 мкм, а общее увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) достигает 2000 раз.

Устройство светового микроскопа:

В микроскоп входят 3 системы: -оптическая,

– осветительная,

– механическая.

1.Оптическая система включает объектив и окуляр.

а) Объектив (1) – это система линз, вставляемая в тубус (2) снизу и непосредственно направляемая на объект (отсюда – и название).

Обычные увеличения объектива:

х8, х20, х40 (сухие объективы), х90 (иммерсионный объектив).

При использовании последнего объектива его следует погрузить в каплю кедрового (иммерсионного) масла, нанесённую на покровное стекло препарата.

б) Окуляр (3) вставляется в тубус сверху. Применяются окуляры с увеличением:
х7, х10, х15.

в) Результирующее увеличение микроскопа – произведение увеличений объектива и окуляра, например: (х20)• (х10) = 200 раз.

г) Таким образом, функция оптической системы -формирование увеличенного изображения препарата на сетчатке глаза наблюдателя.

2.Осветительная система – источник света, зеркало, конденсор и диафрагма.

а) Источник света (4) может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне микроскопа (пример – обычная настольная лампа).

б) Зеркало (5) собирает лучи от источника и направляет их на препарат снизу.

Одна поверхность зеркала – плоская, вторая – вогнутая; последняя используется при искусственном освещении.

в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей.

г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине.Она ограничивает световой поток, падающий на препарат.При использовании объективов с большим увеличением отверстие диафрагмы следует уменьшить – для ослабления сферической аберрации.

3. Механическая система – тубус (2), штатив (8), колонка (9) и предметный столик (10).

а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты.

Они поднимают и опускают тубус для фокусировки изображения объекта на сетчатке глаза наблюдателя.

В итоге, световые лучи проходят следующий путь:

источник света (4) зеркало (5) конденсор (6) диафрагма (7) препарат объектив (1) тубус (2) окуляр (3).

Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете, для чего препарат должен быть достаточно тонким.Заметим также, что микроскоп даёт перевёрнутое изображение объекта.

Для получения правильной информации необходимо последовательное микроскопическое изучение всего цитологического мазка.

Обзор цитологической картины проводят под малым увеличением (х10), детализацию выбранных объектов – под увеличением (х20, х40); далее микроскопическое изучение мазка выполняется под иммерсионным объективом (х90, х100). Вначале проводят систематическое изучение полей зрения по краю мазка.

Затем мазок исследуют методом «систематического перекрестного двухразового шага», который позволяет практически без пропуска изучить каждый миллиметр площади препарата.

Подсобными методами является фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия с использованием флюорохрома, которая применяется преимущественно при массовых профилактических осмотрах женщин.

Люминесцентный метод позволяет видеть клетки и различать их по цвету свечения, возникшего под влиянием флюорохрома, фазово-контрастный – рассмотреть особенность клеток, не прибегая к фиксации и окраске (в нативном состоянии) даже с иммерсионной системой.

Оба метода не требуют много времени на подготовку препарата, однако и не сокращают срока его исследования и не всегда дают возможность уточнить диагноз. Метод нативного препарата при световом микроскопе в цитологическом исследовании играет ориентировочную роль и используется в общем клинико-лабораторном анализе.

Оценка качества окрашенного цитологического препарата.

Качественное окрашивание позволяет правильно идентифицировать клеточные элементы мазка и оценить их особенности при микроскопии.

Хороший качественно окрашенный мазок должен:

– равномерно окрашиваться;

– не содержать артефакты (рыхлые скопления краски) и сморщенные клетки;

– иметьв достаточном количестве равномерно распределенные клетки (все участки мазка должны хорошо просматриваться и не содержать “толстые участки”, содержащие непросматриваемые (плохо просматриваемые) скопления или комплексы клеток);

-окрашивать элективноструктуры цитоплазмы, ядра, ядерного хроматина, ядрышек.

В основе окрашивания клеток лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах.

При применении любой методики окрашивание мазка важно точно соблюдать последовательность процедур приготовления растворов и временные промежутки в течение процесса окрашивания.

Существующие в продаже партии красителя имеют различную интенсивность окраски.

Это обязывает опытным путём установить оптимальные концентрации (разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, который устанавливает при окрашивании серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя, меняя длительность его воздействия. При приготовлении растворов необходимо учитывать рН воды: она должна быть нейтральной (рН 6,8 – 7, 2) что обеспечивается использованием буферных растворов.

Рекомендуемые методы окрашивания цитологических мазков: азур – эозиновый, по Романовскому – Гимзе, Лейшману, Маю–Грюнвальду, Паппенгейму; гематоксилин – эозиновый, метод Папаниколау.

Самым распространённом методом окраски является окраска гематоксилин-эозином. Сочетает в себе основной и кислый красители, поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры (ядра приобретают сине-фиолетовый цвет,
цитоплазма – желтовато-розовыйцвет).

Гематоксилин сам по себе не является красящим веществом. Для того чтобы приготовить краску, гематоксилин подвергают окислению (по методу Эрлиха, Майеру, Караци –калийными квасцами), в результате чего он превращается в красящее вещество – гематеин (сине-фиолетовый краситель). При этом на окисление гематоксилина требуется от 10 дней до 2 – 3 недель.

Этот процесс ускоряют с помощью солей алюминия, хрома, железа и др.

• Квасцовый гематоксилин Майера приготовляют следующим образом: в литре дистиллированной воды растворяют 1 г гематоксилина, 0,2 г йодновато-кислого натрия (KaJ03) и 50 г калийных квасцов.

Затем добавляют 50 г хлоралгидрата и 1 г кристаллической лимонной кислоты. Раствор годен для немедленного употребления и долгое время хорошо сохраняется.

Препарат красят в течение 5 – 10 минут, после чего 10 минут промывают в проточной воде.

• Квасцовый гематоксилин по Эрлиху. Для приготовления красителя 2 г гематоксилина растворяют в 100 см3 96-градусного спирта и добавляют 100 см3 воды, 100 см3 химически чистого глицерина, 3 г калийных квасцов и 10 см3 уксусной кислоты.

Краситель должен «созревать» примерно 14 дней. Раствор сохраняет свою красящую силу долгое время. Если вместо гематоксилина взять 0,25 – 0,5 ггемагина, то краситель пригоден к употреблению тотчас же после изготовления. Окрашивание производят так же, как и гематоксилином Майера. Ядра окрашиваются в темно-синий цвет.

• Квасцовый гематоксилин по Караци. Гематоксилина – 0,5 г, калийных квасцов – 25г, нодноватокислого калия КГО3 – 0,01 г, глицерина – 100 см3, дистиллированной воды – 400 см3.

Преимуществом гематоксилиз-эозиновых красителей является выраженное окрашивание ядер с атипией, в связи с чем этот метод хорошо использовать для исследования мазков при скрининге.

Окраска азур – эозиновыми красителями.

Метод окрашивания по Романовскому (азур-эозиновой смесью) в разных лабораториях используется в разных модификациях – по Паппенгейму (Май-Грюнвельду-Гимзе), Лейшману, Романовскому-Гимзе и т.д. Преимущество метода является четкое прокрашивание ядер, вследствие чего хорошо просматриваются структуры хроматина, а также бактериальная флора и простейшие.

Окраска по Романовскому-Гимзе.Краситель состоит из щелочной части (азур II – ярко-синий цвет), и кислой части (эозин – розово-красный цвет).

В настоящее время используется готовый краситель Романовского-Гимзе, из которого перед началом работы готовят рабочий раствор из расчета 1 капля краски на 1 млдистиллированной воды.

Высохший фиксированный мазок помещается в кювету с рабочим раствором краски на 25-40 минут (конкретное время устанавливается опытным путем для каждой партии красителя).

Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток – в голубой, ядра –в красный. При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра – красно-фиолетовый.

Результаты окрашивания мазков крови:

· Ядра клеток – красно-фиолетовые.

· Эозинофильные гранулы – красновато-коричневые.

· Базофильные гранулы – синие.

· Нейтрофильные гранулы – фиолетовые.

· Цитоплазма лимфоцитов – голубая.

· Эритроциты – бледно-красные.

· Тромбоциты – наружная часть синяя (более светлая); внутренняя – фиолетовая (более темная).

Окраска по Маю-Грюнвальду.Данный метод очень удобен для визуализации гранулоцитов.Для окрашивания применяется готовый раствор эозин-метиленового синего по Маю-Грюнвальду. Мазок без предварительной фиксации заливают красителем, через 5 минут промывают и высушивают.

· Лимфоциты– ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: голубая.

· Моноциты– ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: серо-голубая.

· Гранулоциты – ядра: сине-фиолетовые; гранулы: красные, фиолетовые, темно-синие (зависит от типа).

· Тромбоциты– наружная часть голубая; внутренняя – фиолетовая.

· Эритроциты– розовые.

Окраска по Паппенгейму. Представляет собой комбинацию двух предыдущих методов.Сухие нефиксированные мазки помещаются в кювету с раствором Мая-Грюнвальда на 3 – 5минут.

После этого контейнер с мазками ополаскивается дистиллированной водой, после чего мазки помещаются в кювету с разведенным раствором Романовского-Гимзы на 20 – 30минут.

После этого мазки промываются проточной водой и высушиваются.

· Ядра клеток – красно-фиолетовые.

· Цитоплазма лимфоидных клеток – светло-синяя.

· Лимфоидная азурная грануляция – ярко-синяя.

· Миелоидная азурная грануляция – фиолетовая.

· Нейтрофильные гранулы – светло-фиолетовые.

· Эозинофильные гранулы – красные, красно-коричневые.

· Базофильные гранулы – темно-фиолетовые, черные.

· Эритроциты – розовые (полихроматофильные эритроциты – синеватые).

· ТельцаЖолли – красновато-фиолетовые.

· Тельца Ауэра – ярко-красные.

Методика окраски по Лейшману.Высушенные на воздухе препараты заливают краской Лейшмана на 3 мин., при этом препарат одновременно фиксируется.

После этого промывают водопроводной водой и заливают азур – эозиновой смесью (40 мл 0, 1% азура II и 30 мл 0,1% эозина К) на 15 – 20 мин.

Затем промывают водопроводной водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. используется для выявления малярийных плазмодиев.

Источник: //megaobuchalka.ru/5/12685.html

WikiMedicOnline.Ru
Добавить комментарий